Cerita mengikuti sekelompok sahabat masa kecil yang kini tengah menghadapi krisis paruh baya. Dua sahabat karib, Doug (Jack Black) dan Griff (Paul Rudd), sangat terobsesi dengan film Anaconda (1997). Merasa hidup mereka stagnan, mereka memutuskan untuk pergi ke hutan hujan Amazon demi membuat ulang (remake) film favorit mereka tersebut dengan anggaran seadanya.
Bersama teman-teman lainnya, termasuk Kenny (Steve Zahn) dan Claire (Thandiwe Newton), mereka memulai syuting yang amatir dan penuh kekonyolan. Situasi komedi berubah menjadi maut ketika mereka bertemu dengan seekor Anaconda raksasa sungguhan yang jauh lebih besar dan ganas daripada versi film yang mereka coba tiru. Mereka terjebak dalam pertarungan hidup dan mati melawan predator tersebut, sekaligus menghadapi konflik internal dan penambang emas ilegal di tengah hutan.