Batman: The Killing Joke menceritakan kisah asal-usul Joker dan pertemuannya dengan Batman melalui dua alur cerita terpisah: kisah asal-usul Barbara Gordon, dan kisah tentang bagaimana Joker berusaha membuat Batman menjadi gila dengan membuktikan bahwa satu hari buruk dapat mengubah siapa saja menjadi jahat. Film ini juga menyoroti hubungan rumit antara Batman dan Joker.
- Kisah Barbara Gordon: Film ini dimulai dengan perkenalan karakter Barbara Gordon, putri Komisaris James Gordon, dan menunjukkan kehidupan awalnya sebagai seorang polisi yang idealis. Barbara mengalami trauma saat diserang oleh Joker, yang menyebabkan dia lumpuh.
- Kisah Joker: Film ini secara bersamaan menampilkan dua kisah Joker: masa lalu dan masa kini.
- Masa lalu: Kisah Joker sebagai seorang komedian yang gagal dan mengalami kesulitan ekonomi.
- Masa kini: Joker yang sudah gila mencoba membuktikan pandangannya bahwa manusia pada dasarnya jahat dan hanya membutuhkan satu hari yang buruk untuk berubah menjadi gila. Ia melakukan serangkaian tindakan brutal untuk membuktikan pandangannya kepada Batman, termasuk menyiksa Batman secara fisik dan mental.
- Pertemuan Batman dan Joker: Batman berusaha menghentikan Joker dengan segala cara, sambil berusaha membujuknya untuk kembali ke jalan yang benar. Namun, Joker tidak mengindahkan semua upaya Batman dan justru terus berusaha membuktikan pandangannya kepada Batman.